• Shameik Moore trong vai Miles Morales / Spider-Man:
  Một nghệ sĩ graffiti tuổi teen thông minh và nổi loạn người Mỹ gốc Phi và Puerto Rico, người đã đảm nhận vai trò Người Nhện của Earth-1610 sau cái chết của Peter Parker trong thực tại của anh.[5][6]
• Hailee Steinfeld trong vai Gwen Stacy / Spider-Woman:
  Một phiên bản của Gwen Stacy là Spider-Woman của Earth-65 và là tay trống của một ban nhạc rock, cũng như tình yêu của Miles[6]
• Brian Tyree Henry trong vai Jefferson Morales: Người cha người Mỹ gốc Phi của Miles và một sĩ quan cảnh sát, người ban đầu không tán thành các hành động cảnh giác của Người Nhện nhưng giờ coi Người Nhện như một người hùng.[7]
• Luna Lauren Vélez trong vai Rio Morales: Người mẹ người Puerto Rico của Miles, một y tá. Vélez cũng đóng vai một phiên bản thay thế của Rio Morales từ Earth-42.[7]
• Jake Johnson trong vai Peter B. Parker / Spider-Man:
  Một Peter già hơn, tóc rối bù và tóc ngăm đen từ Earth-616 đối lập với Peter Parker tóc vàng mắt xanh có nguồn gốc từ chiều không gian của Miles, người là người cố vấn miễn cưỡng cho Miles.[8] Parker hiện có một cô con gái tên Mayday với Mary Jane Watson, người mà anh đã làm lành vào cuối Spider-Man: Into the Spider-Verse (2018).[9]
• Jason Schwartzman trong vai Tiến sỹ Jonathan Ohnn / Spot:
  Một cựu nhà khoa học ở Alchemax trở thành siêu ác nhân sau một vụ tai nạn, cơ thể hiện được bao phủ bởi các cổng liên chiều cho phép hắn ta du hành xuyên không gian và các vũ trụ khác nhau. Trong phim, Jonathan chuyển sang cuộc sống tội phạm vì không được nhận bất kỳ công việc nào do ngoại hình của mình và không biết cách sử dụng sức mạnh của mình và/hoặc trở thành một nhân vật phản diện thích hợp.[10] Spot ban đầu không phải là nhân vật phản diện chính của bộ phim mà được đề xuất bởi nhà sản xuất Avi Arad. Phil Lord và Christopher Miller lúc đầu bác bỏ ý kiến này, nhưng sau khi nói nhiều hơn về sức mạnh của anh ta, họ biến hắn thành nhân vật phản diện.[11]
• Issa Rae trong vai Jessica Drew / Spider-Woman:
  Một Spider-Woman người Mỹ gốc Phi đang mang thai từ một vũ trụ thay thế, là thành viên của Spider-Society và lái một chiếc mô tô. Không giống như hầu hết Người Nhện, Drew không duy trì danh tính bí mật.[12][13]
• Karan Soni trong vai Pavitr Prabhakar / Spider-Man India:
  Một phiên bản Ấn Độn của Người Nhện từ một vũ trụ thay thế, sinh sống ở Mumbattan (một sự kết hợp giữa Mumbai và Manhattan), người có được sức mạnh của mình thông qua phép thuật thay vì một con nhện cắn.[9][14]
• Daniel Kaluuya trong vai Hobart "Hobie" Brown / Spider-Punk: Một phiên bản Người Nhện người Anh da đen, punk rock đến từ một vũ trụ thay thế được cai trị bởi chế độ toàn trị và sử dụng cây đàn guitar làm vũ khí chính của mình.[15]
• Oscar Isaac trong vai Miguel O'Hara / Spider-Man 2099:
  Người Nhện "ninja ma cà rồng" cơ bắp của người Ireland và người Mexico đến từ một vũ trụ thay thế lấy bối cảnh năm 2099,[16] ai là thủ lĩnh của Hội Người Nhện, một nhóm Người Nhện từ các vũ trụ thay thế được giao nhiệm vụ bảo vệ Đa vũ trụ. Isaac mô tả Miguel là "Người Nhện duy nhất không có khiếu hài hước",[17] trong khi nhóm sản xuất đặt biệt danh cho anh ta là "Người nhện gây thiệt hại tài sản" do mức độ tàn phá mà anh ta để lại sau khi thức dậy.[10]
• Shea Whigham trong vai George Stacy: Cha của Gwen, đội trưởng cảnh sát săn lùng Spider-Woman ở Earth-65[18]
• Greta Lee trong vai Lyla: Trợ lý AI của Miguel và Spider-Society.[19]
• Mahershala Ali trong vai Aaron Davis của Earth-42: Một biến thể của người chú đã khuất của Miles, người không bao giờ trở thành Prowler.[20]
• Andy Samberg trong vai Ben Reilly / Scarlet Spider: Một bản sao di truyền của Peter Parker từ một vũ trụ thay thế và là thành viên của Spider-Society của Miguel.[21]
• Jharrel Jerome trong vai Miles G. Morales / Prowler: Miles Morales của Earth-42, người đã chuyển sang cuộc sống tội phạm với chú Aaron của mình.
• Amandla Stenberg trong vai Margo Kess / Spider-Byte: Một Người Nhện từ thực tế ảo[22]
• Jack Quaid trong vai Peter Parker ở vũ trụ của Gwen người đã chết sau khi biến thành Lizard.[23]
• Rachel Dratch trong vai bà Weber: Một cố vấn tại trường của Miles.[13][18]
• Ziggy Marley trong vai Lenny: Một chủ cửa hàng người Jamaica.
• Jorma Taccone trong vai Adriano Toomes / Vulture:
  Một siêu ác nhân theo chủ đề kền kền Ý từ một vũ trụ lấy cảm hứng từ thời kỳ Phục Hưng.[10][18] Taccone trước đây đã lồng tiếng Norman Osborn / Green Goblin và Peter Parker / Spider-Man từ bộ anime năm 1967 trong Into the Spider-Verse, cũng diễn lại phần sau trong phim.[24][25]

Các phiên bản bổ sung của Người Nhện xuất hiện trong phim với tư cách là thành viên của Spider-Society, với các vai diễn thuyết, bao gồm: Kimiko Glenn trong vai Peni Parker / SP//dr; Nicolas Cage trong vai Peter Parker / Spider-Man Noir (thông qua các bản ghi âm lưu trữ); John Mulaney trong vai Peter Porker / Spider-Ham (thông qua các bản ghi âm lưu trữ); Elizabeth Perkins trong vai May Parker / Người Nhện Quippy; Taran Killam trong vai Patrick O'Hara / Web-Slinger và con ngựa Góa phụ của anh ta; Nic Novicki trong vai Người nhện Lego; [cần dẫn nguồn] Josh Keaton là Peter Parker / The Spectacular Spider-Man từ loạt phim truyền hình The Spectacular Spider-Man (2008–2009),[21] cũng xuất hiện thông qua các cảnh quay lưu trữ của tập một phần của chương trình, "Intervention";[cần dẫn nguồn] Yuri Lowenthal trong vai Peter Parker / Insomniac Spider-Man từ loạt trò chơi Marvel's Spider-Man của Insomniac Games, cũng xuất hiện thông qua các cảnh của trò chơi Marvel's Spider-Man 2 (2023);[21] Mike Rianda trong vai Ezekiel Sims / Spider-Therapist (mặc dù anh ấy chỉ được ghi nhận là "Giọng nói bổ sung");[26] Sofia Barclay trong vai Malala Windsor / Spider-UK, một hiện thân ban đầu từ các phiên bản truyện tranh; Danielle Perez trong vai Charlotte Webber / Sun-Spider;[27] Metro Boomin trong vai Metro Spider-Man, một phiên bản hư cấu "độc nhất vô nhị" của chính anh với tư cách là Người Nhện;[28][21] và Max Borne / Spider-Man 2211.[21]

Bộ phim cũng bao gồm sự xuất hiện không có giọng nói của Peter Parker / Người Nhện trong loạt phim truyền hình Spider-Man Unlimited (1999–2001), Pter Ptarker / Spider-Rex, Spider-Cat, các Người Nhện mặc đồ đen khác nhau, Bombastic Bag-Man, Cyborg Spider-Woman, Peter Parkedcar / Spider-Mobile, Superior Spider-Man, Stealth / Big Time Spider-Man, Spider-Armor MK I, MK II và MK III, Người nhện vận tốc trong series trò chơi điện tử Marvel's Spider-Man, Electro Proof, Bruce Banner / Spider-Man, Cyclops Spider-Man, Iron Spider, Peter Parker / Spider-Man từ trò chơi điện tử Spider-Man năm 2000 của Neversoft, Peter Parker / Spider-Man từ Marvel Mangaverse, Spider-Cop, Mary Jane Parker / Spinneret và con gái Anna May-Parker / Spiderling từ loạt phim giới hạn năm 2015 Amazing Spider-Man: Renew Your Vows, Maybelle Reilly / Lady-Spider, Spider-Monkey, Spider-Wolf, Future Foundation Spider-Man, Flash Thompson / Captain Spider, Doppelganger, Spyder-Knight từ Ultimate Spider-Man, Spidercide, Prince of Arachne, Last Stand Peter Parker, Jessica Drew (bộ đồ cổ điển), Julia Carpenter / Spider-Woman,[21] Samurai Spider-Man, Canadian Spider-Woman, Ashley Barton / Spider-Kingpin, Spider-Man từ Earth X, Chibi Spider-Man, và Tarantula của Earth-1610A.[29][30] Green Goblin từ trò chơi điện tử Spider-Man (1982) và Video-Man từ loạt phim truyền hình Spider-Man and His Amazing Friends (1981–1983) cũng xuất hiện.[21]

Ngoài ra, May "Mayday" Parker cũng xuất hiện với tư cách là con gái nhỏ của Peter B. Parker và Mary Jane,[21] cùng với một phiên bản người lớn thay thế hoạt động với tư cách là Spider-Girl. Melissa Sturm lồng tiếng Mary Jane "MJ" Parker, vợ của Peter B. Parker và mẹ của Mayday. Nhà làm phim hoạt hình và nhà làm phim của Pixar Peter Sohn lồng tiếng cho người bạn thân nhất và bạn cùng phòng của Miles Ganke Lee, sau khi lời thoại của anh ấy bị cắt khỏi Into the Spider-Verse.[31] Tara Platt lồng tiếng Yuri Watanabe, đồng nghiệp cảnh sát của Đại úy Stacy của Earth-65, đảm nhận vai trò của cô ấy trong loạt trò chơi điện tử Marvel's Spider-Man.[21] Ayo Edebiri, Nicole Delaney và Antonia Lentini lồng tiếng cho các phiên bản Glory, MJ và Betty Brant trong vũ trụ của Gwen, những người bạn cùng nhóm của Gwen trong The MaryJanes.[cần dẫn nguồn] J. K. Simmons cũng đảm nhận vai J. Jonah Jameson, lồng tiếng cho nhiều phiên bản khác nhau của nhân vật.[21] Kathryn Hahn cũng lồng tiếng ngắn gọn cho vai Olivia "Liv" Octavius / Doctor Octopus từ bộ phim đầu tiên.

Các vai người thật đóng cũng xuất hiện trong phim, với Tobey Maguire và Andrew Garfield xuất hiện trong của họ vai trò tương ứng trong vai Peter Parker / Người nhện loạt phim Spider-Man của Sam Raimi và loạt phim The Amazing Spider-Man của Marc Webb qua các đoạn phim lưu trữ. Donald Glover miêu tả một phiên bản thay thế của Aaron Davis / Prowler, người trước đây đã xuất hiện trong phim thuộc Vũ trụ Điện ảnh Marvel Spider-Man: Homecoming (2017). Peggy Lu đảm nhận vai bà chủ cửa hàng tiện lợi Chen từ những phim Venom thuộc Vũ trụ Người Nhện của Sony,[32] nơi được xác định là Earth-688.[33] Cliff Robertson và Denis Leary xuất hiện qua đoạn phim lưu trữ lần lượt là Ben Parker và George Stacy từ Spider-Man (2002) và The Amazing Spider-Man (2012), với các bản ghi âm lưu trữ của Otto Octavius / Doctor Octopus của Alfred Molina từ Spider-Man 2 (2004) được sử dụng cho một phiên bản thay thế của nhân vật của ông với thiết kế giống hệt truyện tranh.[21]